Diagnostic direct vs indirect

Le diagnostic de laboratoire des maladies infectieuses fait appel à deux grands types de techniques :

• des techniques dites directes qui permettent de rechercher l’agent pathogène en cause ou une partie de celui-ci (antigène, génome)
• des techniques indirectes qui mettent en évidence la réponse de l’hôte à l’infection (le plus souvent réponse immunitaire humorale ou "sérologique").

La mise en évidence d’une réponse immunitaire dans un processus infectieux, si elle est facile à mettre en oeuvre, peut aussi parfois poser des problèmes d’interprétation. C’est le cas notamment :

• lorsque la vaccination a été réalisée pour la maladie suspectée,
• lorsqu’il s’agit de faire la différence entre une infection récente ou plus ancienne (mise en évidence d’une augmentation du titre en anticorps ou "séroconversion")
• chez un jeune animal auquel ont été transmis des anticorps d’origine maternelle,
  le développement d’une réponse immunitaire détectable peut être perturbé lorsque l’infection provoque une immunodépression. Le cas typique est celui de la maladie de Carré chez le chien.

Dans tous ces cas il est intéressant de faire appel à des techniques directes de mise en évidence de l’agent infectieux :

• mise en culture,
• mise en évidence de l’agent pathogène en microscopie,
• test immunologique de détection d’antigènes...
• la PCR ou la PCR en temps réel et autres techniques de biologie moléculaire

Les méthodes de diagnostic direct et indirect sont complémentaires, mais pour une même maladie, l’une ou l’autre peut être plus intéressante selon les cas (âge, traitement, durée d’évolution).

Diagnostic moléculaire

Ensemble des méthodes de détection, quantification ou typage dont la cible est un acide nucléique (ADN ou ARN). La PCR (et méthodes dérivées) est la méthode de diagnostic moléculaire la plus utilisée.

LIMS

C’est l’abréviation de Laboratory Information Management System.
Le laboratoire vétérinaire Scanelis a déployé un système de management informatisé du laboratoire (LIMS) afin d’automatiser la traçabilité totale des échantillons de leur enregistrement jusqu’au rendu des résultats et à la facturation.

PCR

Découverte en 1986 par Kary Mullis (prix Nobel de chimie en 1993), la PCR ou Polymerase Chain Reaction est une méthode de détection directe du génome des agents infectieux ou parasitaires par amplification enzymatique d’une partie de celui-ci. Cet outil de biologie moléculaire est très spécifique et permet de détecter de façon reproductible de très faibles quantités d’agents pathogènes dans des prélèvements de nature variée.

En génétique, la PCR est une première étape pour l’étude d’une région génomique donnée. Elle permet de cibler cette région pour rechercher des polymorphismes associés à une maladie ou à une sensibilité particulière à certains agents infectieux ou certains médicaments.

Le principe de la PCR

Deux amorces (oligonucléotides d’environ 20 bases) spécifiques du fragment à rechercher et situées à chaque extrémité de la cible sont utilisées comme "têtes chercheuses".
Bien choisies, ces amorces sont incapables de s’hybrider de façon efficace ailleurs que sur le fragment ciblé, ce qui explique la spécificité de la PCR.
Une fois la cible trouvée, une enzyme thermostable (la Taq Polymérase) synthétise de façon très fidèle de nouveaux fragments d’ADN similaires à ceux de la séquence originale présente dans le prélèvement.
Ces cycles d’hybridation des amorces et de polymérisation d’ADN sont répétés au moins 30 à 50 fois aboutissant à une multiplication exponentielle de la séquence cible originale.
Cette amplification explique la sensibilité des techniques PCR (ou plutôt leurs seuils de détection très bas : la présence de quelques copies de génome viral donne naissance en deux heures à plusieurs milliards de fragments identiques).

Vous pouvez également consulter notre animation présentant les techniques de PCR et de PCR en temps réel.

Les avantages de la méthode...

La PCR est un moyen très performant de diagnostic direct des maladies infectieuses ou parasitaires, notamment dans les phases précoces de l’infection ou lorsque la vaccination ou la présence d’anticorps maternels sont susceptibles d’interférer avec le diagnostic sérologique (diagnostic indirect).
La rapidité des résultats (chez Scanelis, J+1 à J+2) peut s’avérer un avantage décisif notamment si la maladie suspectée est une zoonose (leptospirose), si la mise en oeuvre rapide de mesures sanitaires s’impose dans un élevage (maladie de Carré, Parvovirose) ou encore si le traitement doit être adapté au pathogène présent (Piroplasmose des Equidés).
L’expédition des prélèvements ne nécessite pas de précautions particulières et il est possible de rechercher simultanément plusieurs agents pathogènes dans un même échantillon.

Et ses limites...

Les limites de la PCR tiennent aux difficultés de conception, de mise en oeuvre et d’interprétation des tests.
En conception, il ne suffit pas de choisir deux amorces spécifiques pour développer un test PCR pertinent. De très nombreux facteurs influencent les performances réelles de la technique comme :

• le choix du prélèvement (qui doit contenir l’agent infectieux),
• les techniques de traitement des échantillons avant la PCR (adaptées à chaque type de prélèvement),
• l’optimisation et la validation de la méthode (choix des réactifs, du matériel et des conditions de réactions, inclusion de témoins adaptés : le seuil de détection est-il vérifié sur chaque série ?, détection d’inhibiteurs de PCR).

Le choix de la technologie est décisif. Par exemple il est illusoire d’espérer diagnostiquer une parvovirose chez un chiot vacciné ou de la PIF chez un chat si l’on n’utilise pas de PCR quantitative (PCR en temps réel).

Lors de la mise en oeuvre, un certain nombre d’écueils sont à éviter (contamination des prélèvements au laboratoire, présence d’inhibiteurs ...). Il convient donc de s’adresser à un laboratoire spécialisé et expérimenté dans ces technologies.
De plus l’intérêt du résultat obtenu est étroitement lié à la qualité et au choix des prélèvements : modalités de prélèvements adaptées à la pathologie, choix du prélèvement en fonction de l’évolution clinique, richesse des prélèvements en cellules pour les écouvillons, cytobrosses, ...
Pour l’interprétation des résultats, il est également nécessaire de connaître le pourcentage d’animaux asymptomatiques avec le test utilisé.

PCR en temps réel

Evolution de la PCR, la technique de PCR en temps réel, maîtrisée par Scanelis depuis 2000, permet de détecter des séquences génétiques caractéristiques de l’agent à rechercher. Tous les tests développés et commercialisés par Scanelis utilisent la technique de PCR en temps réel (PCR quantitative).

Principe de la PCR en temps réel

Comme en PCR, deux amorces (oligonucléotides d’environ 20 bases) spécifiques du fragment à rechercher et situées à chaque extrémité de la cible sont utilisées comme "têtes chercheuses".
Une sonde marquée, également spécifique de la séquence cible et interne par rapport aux deux amorces, est ajoutée au milieu réactionnel. Les fragments amplifiés sont mis en évidence au fur et à mesure des cycles de la réaction.
Il est également possible d’utiliser un intercalant de l’ADN à la place de la sonde pour révéler l’amplification mais ces méthodes, moins coûteuses en réactifs sont également moins spécifiques (typage délicat voire impossible).

Vous pouvez consulter notre animation "La PCR en temps réel".

Avantages majeurs par rapport aux méthodes de PCR conventionnelle

• Analyse quantitative des résultats si nécessaire
• Typage des souches en utilisant des sondes fluorescentes spécifiques (ex : souches vaccinales/ souches de terrain)
• Reproductibilité
• Sensibilité très importante
• Sécurité du résultat (pas de risque de contamination et de faux positifs en raison de l’absence d’analyse par électrophorèse)
• Automatisation de l’analyse

Le développement de tests PCR quantitative/PCRtemps réel demande une réelle expertise biomoléculaire.

PCR quantitative

Ce terme est souvent employé pour parler de la PCR en temps réel.

La PCR quantitative permet d’évaluer des charges virales ou parasitaires. C’est une technique qui a beaucoup d’avantages par rapport aux techniques conventionnelles plus anciennes.

La PCR quantitative permet :

• de suivre l’efficacité d’un traitement  ;
• de distinguer un simple portage d’une infection réelle (un des problèmes majeurs dans l’interprétation des résultats de PCR qui est une méthode très sensible) ;
• de distinguer des animaux vaccinés avec une souche atténuée de ceux réellement infectés (parvovirose canine, maladie de Carré...). Cette technologie offre également la possibilité, dans certains cas, de distinguer souches pathogènes et souches vaccinales.

RT-PCR

Lorsque le génome à rechercher est un ARN (virus à ARN), une étape préliminaire à la réaction de PCR permet de réaliser une copie du fragment cible d’ARN en ADN grâce à une enzyme isolée des rétrovirus : la transcriptase inverse (ou Reverse transcriptase). On parle alors de RT-PCR.

Quelques exemples de virus à ARN d’intérêt vétérinaire  :

• Virus de la maladie de Carré
• Coronavirus félin et coronavirus canin
• Calicivirus félin
• Rétrovirus félins : FeLV et FIV
• Pestivirus bovin
• Virus de la maladie hémorragique virale du lapin (VHDV)

Seuil de détection

Le seuil de détection d’un test est la plus petite quantité de séquence cible qui peut être détectée par analyse. En pratique, le seuil de détection est exprimé chez Scanelis en nombre de copies de séquence cible (sur le génome du pathogène recherché).

Pour chaque test développé par Scanelis, ce seuil est déterminé conformément aux recommandations de la Pharmacopée Européenne et de la norme NF U47-600-2 et vérifié sur chaque série d’analyses.
Une analyse statistique sur un grand nombre de points standards de plusieurs gammes de dilutions différentes (au minimum 24 déterminations par quantité) est donc réalisée pour déterminer le seuil de détection à 95% (analyse de Probit). Le seuil de détection fourni (proche de 100% dans les conditions dans lesquelles les tests sont réalisés) est égal au seuil de détection à 95% multiplié par un facteur 3. Des standards positifs correspondant à ce seuil sont intégrés sur toutes les séries d’analyses, ce qui permet de s’assurer de la reproductibilité des résultats. Pour chaque test, le seuil de détection est indiqué sur le document de spécifications des tests PCR Scanelis.

Seuil de quantification

Le seuil de quantification est la plus petite quantité de séquence cible (en nombre de copies) qui peut être quantifiée avec exactitude par la méthode de PCR en temps réel (qui permet de discriminer des quantités variant d’un facteur 2).

Pour chaque test développé par Scanelis, le domaine de linéarité de la PCR est déterminé selon les recommandations de la norme XP U47-600-2 et la borne inférieure de ce domaine constitue la limite de quantification.

En pratique, un résultat positif "inférieur au seuil de quantification" signifie qu’une faible quantité de la cible recherchée (virus, bactérie...) a été détectée avec certitude dans le prélèvement mais que la quantité est trop faible pour être dosée avec précision.